CRISPR-Cas9试剂盒：靶向基因编辑工具

基因编辑是指改变细胞DNA区域的过程。最常见的基因编辑技术包括使基因功能失活（敲除）、引入或校正SNP突变，或在内源基因上添加报告基因标签（敲入）。这些改变是永久性的和遗传性的，从而产生一个新的工程细胞系。

什么是CRISPR CAS9？CRISPR/Cas9是一种RNA引导的靶向基因组编辑工具，允许研究人员在细胞系和动物中进行基因敲除、插入、缺失和SNP编辑。CRISPR/Cas9基因组编辑系统需要两个组分：Cas9核酸酶和引导RNA（sgRNA）。sgRNA将Cas9定位到基因组序列中的特定位置。在3’端存在原始间隔相邻序列（PAM – 序列NGG）时，Cas9将解开DNA双链，并在引导RNA识别到目标序列时切割两条链。

背景  多年来，许多有前途的基因组编辑工具已经开发出来，包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活样效应子核酸酶（TALENs）和CRISPR相关蛋白9（Cas9）。ZFN和TALENs是目标基因组修饰方法，其设计成本高且耗时，限制了它们的广泛应用，尤其是在大规模、高通量研究中。CRISPR-Cas9是一种独特的技术，使遗传学家和医学研究人员能够研究、改变、创建和重建高度复杂的通路、DNA序列、基因和自然生物系统。它目前是最简单、最灵活和最精确的基因操作方法，因此在科学界引起了轰动。它已广泛应用于基因组编辑的广泛领域，例如干细胞工程、基因治疗、组织和动物疾病模型以及工程抗病毒转基因植物，极大地提高了人们对肿瘤基因组学的理解。

产品介绍

我们专注于细胞和基因治疗领域，推出了CAS系列核酸酶，包括Cas9和Cas12a。这些蛋白质主要用于靶向基因编辑，以提供高效的编辑效率。

产品特点：

  • 1.经过体内/体外实验验证的高酶活性：体外片段切割效率>90%，有助于使用CRISPR技术进行基因组编辑。

  • 2.提供高浓度的CAS-9核酸酶：10mg/ml，用于优化更复杂情况下的编辑条件。

  • 3.高纯度：经SDS-PAGE和SEC-MALS验证的纯度>90%。

  • 4.核定位信号（NLS）的引入有助于将酶传递到细胞核，提高基因组DNA切割速率。

  • 5.无残留RNase：生产过程严格无RNase污染。

  • 6.酶活性和纯度已经批次检查。批次之间具有高稳定性和一致性。

CRISPR-Cas9调控机制：通过内源性的非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）修复双链DNA断裂

原核生物与感染它们的病毒之间的相互作用已经进化，导致了多样性的CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统通常分为两类（Class 1和Class 2）。迄今为止，大多数研究人员使用的是Type 2 CRISPR-Cas系统，在这一类中，研究最多的是CRISPR-Cas9系统。

CRISPR-Cas9相关应用

CAR-T疗法中的应用：

  1. 1.生成通用的异基因CAR-T细胞；

  2. 2.增强CAR-T细胞功能。

  3.  

TCR-T细胞疗法的应用：

  • α和β内源性TCR基因替换为人工肿瘤特异性TCR序列。

其他应用：

  • 1.抑制免疫检查点信号通路；

  • 2.筛选肿瘤免疫治疗的新靶点。

以其切割目标DNA底物的能力来衡量。Cas12a实现了>90%的底物切割，与竞争产品相当。
NLS-Cas9核酸酶在包含目标序列的DNA片段上进行了体外DNA切割实验。NLS-Cas9核酸酶的活性大于90%（经过质量控制测试）

CRISPR-Cas9的工作原理

CRISPR/Cas9系统涉及两个关键组分：目标特异性的CRISPR gRNA和Cas9核酸酶。在真核系统中，CRISPR/Cas9通过sgRNA（CRISPR RNA（crRNA)和转录激活样效应子RNA(tracrRNA)的组合）特异性靶向DNA进行基因组编辑。Cas9识别与引导序列相邻的非常短的保守序列（几个核苷酸长度），称为“原间隔相邻序列”（PAM）。一旦定向到DNA靶位点，Cas9产生双链断裂（DSB），可以通过插入缺失引入的非同源末端连接（NHEJ）或高保真同源定向修复（HDR）来修复，从而导致基因敲除效应或基于模板的基因替代。

如何设计sgRNA序列

CRISPR/Cas9基因靶向需要定制的单链引导RNA（sgRNA），其中包含一个目标序列（crRNA序列）和一个招募Cas9核酸酶的tracrRNA序列。下方显示的crRNA区域是一个20个核苷酸的序列，与您感兴趣的基因区域同源，并将指导Cas9核酸酶的活性。

请按照以下准则选择与sgRNA的crRNA序列对应的基因组DNA区域：

DNA目标序列的3’端必须具有原间隔相邻序列（PAM）序列（5’-NGG-3’）。PAM序列上游的20个核苷酸将成为您的目标序列（crRNA），Cas9核酸酶将在PAM上游约三个碱基处切割。

  1. 1.PAM序列本身对于切割是绝对必需的，但它不是sgRNA序列的一部分，因此不应包含在sgRNA中。

  2. 2.目标序列可以位于DNA的任一链上。

我们的在线工具可以检测PAM序列，并列出特定DNA区域内可能的crRNA序列。这些算法还可以预测基因组其他地方的离靶效应，帮助您选择最具特异性的crRNA用于您的研究应用。

设计sgRNA的提示：

  • 根据我们的经验，已测试的多个基因中，最佳的sgRNA在位置1处有一个G，位置17处有一个A或T

生成sgRNAs

  • 合成您的sgRNA，使用Guide-it sgRNA体外转录试剂盒。该试剂盒使用PCR生成包含sgRNA编码序列的模板DNA（由您的crRNA和tracRNA组成），受T7启动子控制。然后，使用PCR产物模板进行体外转录，产生可以用于效率测试和/或细胞转导的sgRNA。

选择最有效的sgRNA

即使您选择了符合上述要求的目标序列，sgRNA的特异性和活性仍然是不可预测的。因此，通常建议设计多个不同的sgRNA来靶向感兴趣的基因。我们的Guide-it sgRNA筛选试剂盒提供了一种简单而强大的体外方法，用于在细胞转导之前评估sgRNA的效率，从而帮助您确定最有效的CRISPR。

通过我们的CRISPR-Cas9试剂，研究人员可以对几乎任何细胞类型中的任何基因进行有针对性的、特定的修改。此外，还提供了各种预制的编辑细胞系列和专业的基因组工程服务。